Primer Premier 5.0

软件介绍  

Primer Premie是一种用来帮助研究人员设计最适合引物的应用软件利用它的高级引物搜索引物数据库巢式引物设计引物编辑和分析等功能可以设计出有高效扩增能力的理想引物也可以设计出用于扩增长达50kb以上的PCR产物的引物序列。

    该软件主要由一下四个主要功能板块组成

       ·GeneTank 序列编辑

       ·Primer 引物设计

       ·Align 序列比较

       ·Enzyme 酶切分析

       ·Motif 基序分析

Primer Premier最新版本是6.25,但是很多人人习惯于用5.0这个经典版本,并且认为比后来的更新版本更好用。

内含以下版本:

Primer Premier 5.0 32位/64位绿色版本

链接:https://pan.baidu.com/s/181yozlFEXqlFm8PgYnRJmw 

提取码:wacl 

备用链接: http://pan.baidu.com/s/1hq2h4vM 

提取码: mmfu

【安装方法】

1、下载并解压Primer Premier 5.0算号器压缩包;

2、安装并运行Primer Premier 5.0(如图1);

3、点击Activate Product(如图2);

4、运行算号器,在Machine ID中输入上图所示数字,点击Generate(如图3);

5、将上图所示Activation Key输入图2中,出现如下提示(如图4)。

到此,Primer Premier 5.0已被成功激活,即可正常使用。

读完本文您将获得以下技能

0. 学会获取目的基因的CDS序列;
1. 学会设计引物;
2. 掌握Primer Premier 5的使用方法;
3. 懂得如何选择以及在引物上添加酶切位点;
4. 获取cDNA的多种渠道;
5. 初步掌握质粒构建的技能;
6. 获得快速构建质粒的高逼格技能

引物设计

通常我们要通过PCR获取目的基因片段,所以质粒构建第一步就是设计引物。首先大体了解一下引物设计的一些通用原则:

1. 引物长度一般在15~30 bp,最常用的是18~27bp;

2. 引物GC含量在40%~60%之间,Tm值最好在72℃左右。Tm值简单粗暴的计算方法为Tm=4×(G+C)+2×(A+T),或在此基础上减5℃;

3. 引物3’端不能选择A,最好选择T,G/C的错配率介于A/T之间;

4. 以上为最主要的原则,另外还要注意引物的特异性、引物内部不能形成二级结构等原则,具体可以百度之;

当然以上原则并不一定非要完全符合,但是作为一个新手而言初期最好是严格遵守为妙。下面就以构建人源PD1(PDCD1)为例为大家讲解。

CDS的获取

要设计引物自然要知道这个基因的CDS序列了。获取一个基因CDS序列的方法如下:
打开NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov),如下图,按照顺序,在1处选择Nucleotide,在2处输入“PDCD1”,点击3处的Search,等出来结果之后点击4处的“Homo Sapiens”进行进一步筛选(如果你要做鼠源的就选Mus musculus,其他种属选择相应的名称即可进一步筛选了)

然后第一条就是我们需要的序列信息,点击进去,往下拉,直到看到CDS(如下图)

点击CDS,就出现了下图中所示内容,其中加了底色的部分序列便是我们需要的序列了,可以看到这段序列开头是ATG起始密码子,最后三位是TGA终止密码子。选中这段序列复制即可。

还可以点击右下角的FASTA得到下图所示内容,这边也可以方便的复制目的基因的CDS序列。

由于需要PCR整个CDS区域,所以正反向引物并没有多少选择的余地,甚至可以参照上述原则简单粗暴的从正反向各选择22个碱基左右作为引物,例如:


正向引物序列与CDS相同,反向引物序列与CDS互补。另外要注意的是写引物等序列都是要5’到3’的方向,一般不会从3’到5’,所以我们的CDS虽然没有注明方向,但是其实也是5’到3’。


虽然可以这么简单粗暴的设计引物,但是还是想借此教大家使用一下引物设计的经典软件Primer Premier 5。

Primer 5的使用

如下图,首先点击File->New->DNA Sequence,


然后点击空白处Ctrl+V粘贴我们的CDS序列,选择As is,即我们复制的是什么样的序列就粘贴的什么样的序列。

下面的依次是“反向序列粘贴”、“互补序列粘贴”“反向互补序列粘贴”。

点击左上角的Primer,如下图,S=Sense,A=Antisense

如果对现在的引物不满意,还可以点击Edit Primers编辑序列,如下图,我们删除掉末尾三个碱基,之后需要先点击Analyse,然后才能点击OK,我们可以看到正向引物已经从25个碱基变为22个碱基了。

最后点击Edit->Copy->Sense Primer,粘贴到Word中即可得到正向引物,反向引物Copy之后粘贴也会自动变为5’到3’的序列。所以非常方便,Primer 5还有很多强大的功能,你可以自行探索,也可以加小编微信(amateur_1988)拉入官方微信群交流。

这样我们PDCD1用于PCR的正反向引物就初步设计好了。如果你只是想P出PDCD1这个基因,现在的引物就可以送去合成了,但是如果你想将其构建到载体上,那么我们还要对其进行进一步的加工。

Primer 5的使用

根据不同的目的,可以选择不同的载体,如过表达(pcDNA 3.0)、敲减(pLKO.1-TRC)、原核纯化(pGEX-4T1、pET-28a)、病毒包装(pMSCV-puro)、敲除(lentiCRISPR v2)等。下面我们就以过表达载体pcDNA 3.0为例进行讲解。


从质粒图谱上可以看到多克隆位点有多个酶切位点可以选择,那是不是每个位点都可以用呢?当然不是!我们要选择那些PDCD1(或其他目的基因)本身没有的酶切位点!

所以我们还需要用Primer 5来分析一下哪些是PDCD1所没有的。

还是打开Primer 5,然后粘贴CDS序列,点击Enzyme,2为所有的酶,我们比对质粒图谱选择多克隆位点的酶,双击即可到3的框中,选好之后点击OK,可以看到PDCD1中有ApaI和KpnI两个酶切位点,所以这两个不可以选,其他的都可以选。


不过一般选择常用好用的最好是实验室就有现成的那些酶了。比如我们选择EcoRI和XhoI,那么我们就可以在对引物加上相应的酶切位点了。

于是我们得到如下引物:


好了,我们现在就可以将这些引物送去相应公司合成了。

质粒构建

终于到正题了!

待引物合成之后,我们用ddH2O将其稀释到100 μM作为母液,取一些稀释到10 μM做下一步实验了。

首先我们P出目的基因,这一步建议用高保真PCR酶,小编常用的是Toyobo公司的KOD-PLUS-Neo酶。反应体系及反应条件如下图:

模板的获取

1. 找到表达(最好高表达)该基因的细胞或者组织,用TRIzol法抽提RNA,然后用反转录试剂盒得到相应的cDNA作为模板;

2. 免费索取。给大家推荐一个可以免费索取cDNA的地址:http://hanlab.xmu.edu.cn。韩家淮院士为大家免费提供cDNA,只需要进入该网址点击左侧导航栏的cDNA索取”即可免费获取韩家淮院士实验室的cDNA了!

PCR完成之后跑1%的胶回收目的片段,也可以直接用PCR Clean试剂盒回收。回收之后将其双酶切,同时需要酶切适量载体。如果你使用的是Fermentas (Thermo)的酶,还可以打开网址http://t.cn/RVuwBVo查询双酶切所用的最佳Buffer。

酶切回收之后的片段进行连接,小编使用的是Thermo公司的T4连接酶,体系如下:

现在的T4连接酶基本都是快酶,比如Thermo的这款声称10 min就可以连接完成,不过小编保险起见,一般连接30 min,切勿连接过夜!

连接完成之后便是转化,挑菌(单克隆),摇菌抽提质粒,送去测序就OK了!

Leave a Reply

Fill in your details below or click an icon to log in:

WordPress.com Logo

You are commenting using your WordPress.com account. Log Out /  Change )

Google photo

You are commenting using your Google account. Log Out /  Change )

Twitter picture

You are commenting using your Twitter account. Log Out /  Change )

Facebook photo

You are commenting using your Facebook account. Log Out /  Change )

Connecting to %s

This site uses Akismet to reduce spam. Learn how your comment data is processed.